Detección y expresión de una proteína de unión a calmodulina durante el ciclo celular asexual de Plasmodium falciparum / Detection of Giardia lamblia Colombian strains antigens in eluates from human faeces using the specific anti-31, 65 and 170 kDa parasitic policlonal antibodies by ELISA

Los organismos vivos han establecido varios mecanismos con los cuales traducen las señales extracelulares a un mensaje intracelular que puede ser entendido por la maquinaria bioquímica de la célula. En eucariotes la calmodulina juega un papel central en el procesamiento de la señal de calcio, disparando respuestas bioquímicas altamente específicas que se ejercen a través de las proteínas de unión a calmodulina PUCaM, proteínas que se convierten realmente en las moléculas efectoras de una cascada de eventos donde la respuesta final depende de la PUCaM activada. En Plasmodium falciparum se ha reportado la presencia de calmodulina y se sabe que el calcio juega un papel determinante en diferentes eventos del parásito, sin embargo aun no se ha establecido el compromiso de las PUCaMs. En el grupo de bioquímica del INS se aislaron 9 PUCaMs, de las cuales se escogió una de 30 kDa para este estudio. Se produjo un anticuerpo monoclonal contra la PUCaM de 30 kDa que nos permitió detectar, localizar y establecer el patrón de expresión de la proteína durante el ciclo asexual del parásito. Mediante Western blot se detectó la proteína de interés en extractos de parásito como una banda a la altura de 30 kDa y adicionalmemte el anticuerpo presentó reacción cruzada con las cadenas de la espectrina sugeriendo la presencia de un epítope similar o una estructura estrechamente relacionada en ambas proteínas. Los estudios de localización celular se realizaron por inmunofluorescencia indirecta y éstos mostraron una señal fluorescente dispersa únicamente en el citoplasma del parásito. Ni la membrana, ni el citoplasma de los eritrocitos infectados y los eritrocitos sanos presentaron fluorescencia, corroborando el origen plasmodial de la proteína de 30 kDa. La cinética de expresión reveló que esta proteína es expresada de una manera estado específica (en estadios maduros de 40 y 48 horas) lo que lleva a pensar que la PUCaM de 30 kDa es regulada a lo largo del desarrollo del parásito- Este estudio preliminar confirma la presencia de una proteína de union a calmodulina de 30 kDa en Plasmodium falciparum y abre grandes interrogantes que plantean la necesidad de continuar con estudios futuros para determinar con exactitud la identidad de la proteína y llegar a establecer su papel en los diferentes procesos del parásito, así como entender la fisiología de la señal de calcio en este organismo

Aislamiento y caracterización de proteínas de unión a calmodulina en el Plasmodium falciparum

Se detectaron en el citoplasma de P. falciparum, por Cromatografía de afinidad a calmodulina-agarosa en presencia de 0.2 mM calcio, nueve proteínas de unión a calmodulina de 135.0, 81.5, 66.0, 58.6, 45.0, 41.0, 36.5, 30.0 y 24.5 kDa que fueron eluidas con 1mM EGTA. Las mismas proteínas fueron identificadas independientemente por prueba de immunocoprecipitación de un extracto del parásito marcado con superíndice 35S-Met, usando calmodulina bovina y un anticuerpo monoclonal contra ésta. Cuando las nueve proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE y transferidas a membrana de PVDF, ocho de ellas mantuvieron la habilidad de unirse a calmodulina biotinilada. Las proteínas fueron aisladas por Cromatografía de afindad, seguida por electroforesis preparativa e inoculadas en ratones Balb-C para producir anticuerpos monoclonales con los que se estudió su localización por Inmunofluorescencia e Inmunomicroscopia electrónica en los diferentes estadios del parásito. Igualmente se detectaron por inmunocoprecipitación dos bandas con peso mol superior a 205.0 kDa con capacidad de unión a un anticuerpo anti-espectrina. Una de las proteínas de unión a CaM (36.500) fue aislada y sometida a ruptura enzimática con tripsina, diseñandose a partir del extremo N-terminal de los fragmentos obtenidos, oligonucleótidos degenerados con los que se hizo amplificación del genoma del parásito por PCR, lográndose aislar un fragmento de 554 pb, que presentó una alta homología con la glutamato sintasa, proteína altamente relacionada con cloroplastos de algas y plantas, planteándose la probable importancia que esta proteína tiene tanto en la historia evolutiva de los aplicomplexas, como en el diseño de fármacos que permitan nuevas alternativas para elcontrol de las enfermedades ocasionadas por éste grupo de organismos